，邀请高校、科研院所、临床、生物技术企业等流式研发技术、应用专家分享技术心得和经验，方便生命科学领域研究人员了解有关技术应用进展、学习仪器使用方法。

  中科蓝华（广州）生物医药技术有限公司的谢简明老师、亢中奎老师带我们不难发现全光谱流式的那些事儿 。

  （广州）生物医药技术有限公司作为大陆第一台第一批全光谱流式使用人员，和大家伙儿一起来分享一些其他用户经常问到的问题。本着互相学习交流，共同进步，先知觉后知，先觉觉后觉，如有不妥或者谬误，请各位指教。

  Q1.为什么称“她”为全光谱流式？答：全光谱流式是相对传统流式而言，传统流式只检测发射光谱中特定波长的荧光，全光流式检测发射荧光的所有波长。传统是检测最高峰段荧光，全光谱流式是检测整个荧光发射谱图。

  答：全光谱流式一般不需要调补偿，“她”是通过解析算法，分开各荧光。只有当解析出现瑕疵，为追求完美，才会用手动进行补偿微调。

  答：从Raw文件到Unmixed文件，就叫做解析。当发射荧光重叠混合在一起（MIX），把特定荧光的量区分开来就叫解析。在特定激发光条件下，荧光素有其特定荧光谱图，整体荧光可看做各荧光谱图的混合，把混合荧光的逐一分开就叫解析。好比一团不一样的颜色的线团，抽出特定颜色的线.

  全光谱流式仪器参数与单染设置？答：全光谱流式一般不需要调电压，根据每日质控会给出一个最优电压组合；其余参数如FSC、SSC、阈值、流速、圈门、获取数等可根据自身的需求自行设置。整体荧光的解析是根据各个荧光的特征谱图拆解而来，因此想要准确解析，单染就必须准确代表。一般单染设置和样本同等操作条件，即同试剂、同浓度、同操作、同设置、同时间。若低表达或连续表达能选用补偿微球替代细胞作为单染，单染抗体浓度可大于样本用量。不必每次实验都做单染，但为了准确解析，需要使单染和检验测试样本状态尽可能一致。Q5.

  答：可查看解析后的单染，解析准确时只有单染荧光有阳性，且单染标记横平无喇叭状；或在样本中看N×N图，是否全部横平竖直。简单panel正常情况下不会出现一些明显的异常问题，多色配色N×N图难免出现个别偏斜，若问题不是很严重，可忽略或手动调补偿。样本最后检测结果两两组合即所有N×N图都横平竖直是流式数据优秀的黄金标准，一句话“黑猫白猫，抓住老鼠就是好猫，横平竖直就是好的”。Q6.

  答：质胜文则野，“质”的本意就是朴素无修饰的意思，理论上单染中的空白对照（Unstained）应该是无荧光（这时叫做质）。实际上却往往出现荧光信号，已经不同于“空白”，所有称异质性自发荧光。自发荧光可归于NADH、叶酸、视黄醇、核黄素等生物大分子受激光激发而产生荧光。为准确解析，应该把他们去除掉或者作为单染荧光参与解析。Q7.

  应该明白，流式虽没有完美配色，但依旧有其规则。强抗原搭配弱荧光，共表达抗原搭配荧光差异最大化（CD3、CD4共表达，CD3-FITC与CD4-BB515组合就不如CD3-FITC与CD4-APC组合。因为FITC和BB515近与APC远，且FITC与BB515为蓝光激发，APC为红光激发。荧光横竖都比较远，横代表最高峰所在检测通道，竖代表所需激发光）。有时按下葫芦起了瓢，有合适荧光素没抗体，有抗体时荧光素已经用了，需要考虑，做好风险平衡。Q8.

  以三激光38通道为例，目前官方公布实测Panel多达24色，本人测过20色Panel，理论上Panel可含更多荧光（38-2）。在实际应用中，目前主要受制于荧光素及抗体试剂的开发。Q9.

  可能可以，全光谱流式是通过荧光谱图的差异来区别开，而非简单最高峰。但如果整个荧光谱图极其相似，相似指数大于0.98，则不能区分开来。好比双胞胎太像了，亲妈都分不开。Q10.

  全光谱流式数据和传统流式，依旧是FCS形式文件，只不过有含有两个文件，一个是未解析的Raw文件，另一个是解析后的Unmixed文件，一般选择Unmixed文件分析就好。当流式文件数据量大（几十G），参数维度多（20+）时，在大多数情况下要一些技巧。流式数据看到的细胞是虚拟化的点，每个点包含不同维度的信息，一个个点构成了流式数据，因此数据可拆可合，可升维亦可降维。给出以下建议供各位参考：拆开处理：如拆开成单一细胞群体FCS文件，如：NK、CD8+、CD4+单独分析；数据剔除：把记录的碎片、死细胞（计算活率时除外）去除掉，生成新的FCS文件；

  删除参数：一些参数是机器自带（如时间、体积），可以删除，由此减少文件大小；

  降维处理：为方便查看结果，降维之后可在二维平面上查看（推荐用T-SNE）。

  谢简明，中科蓝华（广州）生物医药技术有限公司流式专员。组织参与多个流式实验设计及实验操作、临床流式样本数据收集、免疫检测流式数据整理分析，擅长流式高维数据的降维分析。2020年受仪器信息网邀请，作“基于全光谱流式高维数据的降维聚类分析”报告，受到广泛好评（B站浏览量3000多人次）。自2018年公司购入大陆第一台CytekAurora，公司流式平台已发表多篇论文。

  亢中奎，中科蓝华（广州）生物医药技术有限公司流式仪器平台负责人，有多年的流式细胞术实践经验，对大型全光谱流式多色实验实验设计和实施有比较丰富的经验，对Flowjo软件对高维流式数据来进行tSNE降维分析、FlowSOM、Phenograph自动分群算法有比较深入的理解，善于发现未知细胞群体。因采购调研，对各主流厂家的流式细胞分析仪均有所了解。

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