,邀请高校、科研院所、临床、生物技术企业等流式研发技术、应用专家分享技术心得和经验,方便生命科学领域研究人员了解有关技术应用进展、学习仪器使用方法。
中科蓝华(广州)生物医药技术有限公司的谢简明老师、亢中奎老师带我们不难发现全光谱流式的那些事儿 。
(广州)生物医药技术有限公司作为大陆第一台第一批全光谱流式使用人员,和大家伙儿一起来分享一些其他用户经常问到的问题。本着互相学习交流,共同进步,先知觉后知,先觉觉后觉,如有不妥或者谬误,请各位指教。
Q1.为什么称“她”为全光谱流式?答:全光谱流式是相对传统流式而言,传统流式只检测发射光谱中特定波长的荧光,全光流式检测发射荧光的所有波长。传统是检测最高峰段荧光,全光谱流式是检测整个荧光发射谱图。
答:全光谱流式一般不需要调补偿,“她”是通过解析算法,分开各荧光。只有当解析出现瑕疵,为追求完美,才会用手动进行补偿微调。
答:从Raw文件到Unmixed文件,就叫做解析。当发射荧光重叠混合在一起(MIX),把特定荧光的量区分开来就叫解析。在特定激发光条件下,荧光素有其特定荧光谱图,整体荧光可看做各荧光谱图的混合,把混合荧光的逐一分开就叫解析。好比一团不一样的颜色的线团,抽出特定颜色的线.
全光谱流式仪器参数与单染设置?答:全光谱流式一般不需要调电压,根据每日质控会给出一个最优电压组合;其余参数如FSC、SSC、阈值、流速、圈门、获取数等可根据自身的需求自行设置。整体荧光的解析是根据各个荧光的特征谱图拆解而来,因此想要准确解析,单染就必须准确代表。一般单染设置和样本同等操作条件,即同试剂、同浓度、同操作、同设置、同时间。若低表达或连续表达能选用补偿微球替代细胞作为单染,单染抗体浓度可大于样本用量。不必每次实验都做单染,但为了准确解析,需要使单染和检验测试样本状态尽可能一致。Q5.
答:可查看解析后的单染,解析准确时只有单染荧光有阳性,且单染标记横平无喇叭状;或在样本中看N×N图,是否全部横平竖直。简单panel正常情况下不会出现一些明显的异常问题,多色配色N×N图难免出现个别偏斜,若问题不是很严重,可忽略或手动调补偿。样本最后检测结果两两组合即所有N×N图都横平竖直是流式数据优秀的黄金标准,一句话“黑猫白猫,抓住老鼠就是好猫,横平竖直就是好的”。Q6.
答:质胜文则野,“质”的本意就是朴素无修饰的意思,理论上单染中的空白对照(Unstained)应该是无荧光(这时叫做质)。实际上却往往出现荧光信号,已经不同于“空白”,所有称异质性自发荧光。自发荧光可归于NADH、叶酸、视黄醇、核黄素等生物大分子受激光激发而产生荧光。为准确解析,应该把他们去除掉或者作为单染荧光参与解析。Q7.
应该明白,流式虽没有完美配色,但依旧有其规则。强抗原搭配弱荧光,共表达抗原搭配荧光差异最大化(CD3、CD4共表达,CD3-FITC与CD4-BB515组合就不如CD3-FITC与CD4-APC组合。因为FITC和BB515近与APC远,且FITC与BB515为蓝光激发,APC为红光激发。荧光横竖都比较远,横代表最高峰所在检测通道,竖代表所需激发光)。有时按下葫芦起了瓢,有合适荧光素没抗体,有抗体时荧光素已经用了,需要考虑,做好风险平衡。Q8.
以三激光38通道为例,目前官方公布实测Panel多达24色,本人测过20色Panel,理论上Panel可含更多荧光(38-2)。在实际应用中,目前主要受制于荧光素及抗体试剂的开发。Q9.
可能可以,全光谱流式是通过荧光谱图的差异来区别开,而非简单最高峰。但如果整个荧光谱图极其相似,相似指数大于0.98,则不能区分开来。好比双胞胎太像了,亲妈都分不开。Q10.
全光谱流式数据和传统流式,依旧是FCS形式文件,只不过有含有两个文件,一个是未解析的Raw文件,另一个是解析后的Unmixed文件,一般选择Unmixed文件分析就好。当流式文件数据量大(几十G),参数维度多(20+)时,在大多数情况下要一些技巧。流式数据看到的细胞是虚拟化的点,每个点包含不同维度的信息,一个个点构成了流式数据,因此数据可拆可合,可升维亦可降维。给出以下建议供各位参考:拆开处理:如拆开成单一细胞群体FCS文件,如:NK、CD8+、CD4+单独分析;数据剔除:把记录的碎片、死细胞(计算活率时除外)去除掉,生成新的FCS文件;
删除参数:一些参数是机器自带(如时间、体积),可以删除,由此减少文件大小;
降维处理:为方便查看结果,降维之后可在二维平面上查看(推荐用T-SNE)。
谢简明,中科蓝华(广州)生物医药技术有限公司流式专员。组织参与多个流式实验设计及实验操作、临床流式样本数据收集、免疫检测流式数据整理分析,擅长流式高维数据的降维分析。2020年受仪器信息网邀请,作“基于全光谱流式高维数据的降维聚类分析”报告,受到广泛好评(B站浏览量3000多人次)。自2018年公司购入大陆第一台CytekAurora,公司流式平台已发表多篇论文。
亢中奎,中科蓝华(广州)生物医药技术有限公司流式仪器平台负责人,有多年的流式细胞术实践经验,对大型全光谱流式多色实验实验设计和实施有比较丰富的经验,对Flowjo软件对高维流式数据来进行tSNE降维分析、FlowSOM、Phenograph自动分群算法有比较深入的理解,善于发现未知细胞群体。因采购调研,对各主流厂家的流式细胞分析仪均有所了解。
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